传代培养的方法

传代前准备--胰蛋白酶消化--吹打分散细胞--分装稀释细胞--继续培养

1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉, 然后用D-Hanks液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶的消化作用)。

2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加0.4ml, 37度消化5min,镜下看到细胞变圆,间隙增大。

3)立即加含10%FCS的培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞的损伤极小。

4)离心,弃上清,加新的培养液(10%FCS),小心吹匀,分装入新的培养瓶。

传代

培养注意事项:

1、不要轻易改变培养液,我曾经把MEM换成1640后,细胞传几代后莫名其妙死亡。

2、如果想节省消化液,上面第2步可换成3-5mlDPBS洗,主要是去除培养瓶里会影响消化液作用的成分。

3、自配消化液一定要调PH(=7.8-8)值,并且注意分装,-20度保存,避免反复冻融,用前37度预热,消化较好较快。

4.严格的无菌操作

5.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。